RESUMO
Abstract Background: Shrimp farming is evolving from semi-intensive to hyper-intensive systems with biofloc technology and water recirculation systems. Objective: To evaluate the transcriptional response promoted by biofloc on shrimp (Litopenaeus vannamei) under a recirculating aquaculture system (RAS). Methods: Quantitative real-time RT-PCR was used to monitor seven key genes related to the immune system in shrimp post-larvae, reared in a RAS with and without biofloc (BF and no- BF). In addition, we present for the first time nucleotide sequences of ADP-ribosylation factor 4 (LvArf4) from Litopenaeus vannamei. Results: Transcripts for penaeidin3 (Pen3), penaeidin4 (Pen4), crustin, and Toll receptor (LvToll) genes were up-regulated between 3 and 24 h in both systems, and tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6) in no-BF as an early response. Regarding differential expression between treatments, 13 occurrences were encountered. Nine that were higher in BF than in no-BF and four higher in no-BF than in BF. In some sample times, expression of Pen3, crustin, LvToll, TRAF6, IMD, and LvArf4 was higher in BF than in no-BF and in others, expression of Pen3, Pen4, and TRAF6 was higher in no-BF than in BF. Conclusions: BF modulates the transcription of genes related to the immune response in shrimp as an early response. However, the RAS with no-BF promotes a similar response.
Resumen Antecedentes: Los cultivos de camarón están evolucionando de sistemas semi-intensivos a hiper-intensivos con biofloc y con recirculación. Objetivo: Evaluar la respuesta transcripcional promovida por el biofloc en un sistema acuícola con recirculación (SAR). Métodos: Monitoreamos mediante RT-PCR cuantitativo siete genes relacionados con el sistema inmune en postlarvas de camarón cultivadas en un SAR con y sin biofloc (BF y no-BF). Además, presentamos por primera vez la secuencia de nucleótidos del factor de ribosilación 4 de ADP (LvArf4) de Litopenaeus vannamei. Resultados: Los genes penaeidina3 (Pen3), penaeidina4 (Pen4), Crustina y Toll (LvToll) se sobre-expresaron entre las 3 y 24 h en ambos sistemas, y el factor 6 asociado al factor de necrosis tumoral (TRAF6) en BF como una respuesta temprana. Con respecto a la expresión diferencial entre los tratamientos, se presentaron 13 ocurrencias. Nueve donde el BF fue mayor que sin-BF y cuatro donde el no-BF fue mayor que el BF. La expresión fue más alta en BF que en no-BF en Pen3, Crustin, LvToll, TRAF6, IMD y LvArf4. En contraste, la expresión fue mayor en no-BF en Pen3, Pen4 y TRAF6. Conclusión: el BF modula la transcripción de los genes relacionados con la respuesta inmune en camarón como una respuesta temprana. Sin embargo, el SAR sin-BF promueve una respuesta similar.
Resumo Antecedentes: A criação de camarões está evoluindo de sistemas semi-intensivos para hiper-intensivos como tecnologia de bioflocos e sistemas de recirculação. Objetivo: Avaliar a resposta transcricional promovida pelo biofloco em um sistema de aquicultura recirculante (SAR). Métodos: Utilizamos RT-PCR quantitativo em tempo real para monitorar sete genes-chave relacionados ao sistema imune em pós-larvas de camarão, criados em SAR com e sem bioflocos (BF e no-BF). Além disso, apresentamos pela primeira vez sequências nucleotídicas do fator de ribosilação do ADP 4 (LvArf4) de Litopenaeus vannamei. Resultados: Os resultados mostraram que o Penaeidina3 (PEN3), Penaeidina4 (Pen4), Crustina e Toll genes (LvToll) foram sobre-expressos entre 3 e 24 h em ambos os sistemas, e o Factor de Necrose do Receptor 6 associado e protuberância (TRAF6) no BF como uma resposta precoce. Com relação à expressão diferencial entre tratamentos, 13 ocorrências foram apresentadas. Nove onde o BF foi maior do que os não-BF e quatro onde o não-BF foi maior do que o BF. A expressão foi maior do que em BF não-BF em Pen3, Crustin, LvToll, TRAF6, IMD e LvArf4. Em contraste, a expressão foi mais elevada no não-BF em Pen3, Pen4 e TRAF6. Conclusões: O BF modula a transcrição de resposta imune relacionada no camarão como um genes de resposta precoce. No entanto, o SAR não BF promove uma resposta semelhante.
RESUMO
Antimicrobial peptides (AMPs) are components of innate immune system, are present in all living organisms, acting quickly and in unspecific way as a chemical barrier and they have antimicrobial activity. β-defensins is a major family of AMPs with characteristic β- sheet-rich fold, six conserved Cys with particular spacing and intramolecular bonds. They are extensively studied in mammals but scarcely in snakes. The β-defensin Defb-Lm02, of Lachesis muta snake, is codified by a gene structured in three exons and has 38 amino acid residues, molecular weight of 4.6 kDa, net charge of +8 at pH 7 and isoelectric point (pI) of 10.35. The synthetic linear peptide of Defb-Lm02 was tested to antimicrobial activity: it presented the minimum inhibitory concentration against Gram negative bacteria: Escherichia coli 16 μg/mL and Citrobacter freundii 16 μg/mL; and Gram positive: Micrococcus luteus 4 μg/mL and Staphylococcus aureus 32 μg/mL. It did not inhibit the growth of Gram-negative Klebsiella pneumonia, Serratia marcescens, Providencia rettgeri and Morganella morganii until the concentration of 64 μg/mL. These results may be due to the linearity of synthetic peptide. As the defense tasks of β-defensin could be dependent on their 3D structure, the production of recombinant β-defensin may potentiate its antimicrobial activity or suggest a new function. The synthetic gene, maltose binding protein (MBP) – TEV protease recognition site – DefbLm02, was cloned into the pET28a expression vector. The protein was expressed in E. coli BL21 Star and C43, at two temperatures 30 ° C and 37 ° C. After 4 hours of induction with IPTG 1 mM, which showed the best condition of expression was BL21 Star at 30 °C. The major part of fusion protein was soluble after purification by affinity chromatography and after proteolysis. The protein fusion was checked by Western blot using an antibody anti-MBP.
Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) fazem parte do sistema imune inato, presente em praticamente todas as formas de vida, age de maneira rápida e inespecífica, como uma barreira química e possuem atividade antimicrobiana. As β-defensinas são uma importante família de PAMs com características ricas em folhas β, seis Cys conservadas com espaçamento particular e ligações intramoleculares, são extensivamente estudadas em mamíferos, mas raramente em serpentes, e podem refletir uma adaptação de peptídeos de defesa epitelial do hospedeiro. A Defb-Lm02, uma defensina da serpente Lachesis muta, é codificada por um gene estruturado em três exons cuja tradução ao peptídeo maduro consiste em 38 resíduos de aminoácidos, massa molecular de 4,6 kDa, carga líquida de +8 em pH 7, ponto isoelétrico (pI) de 10,35. Esse peptídeo foi sintetizado na forma linear e testado para atividade antimicrobiana, resultando nas seguintes concentrações inibitórias mínima contra bactérias Gram negativa: Escherichia coli 16 μg/mL e Citrobacter freundii 16 μg/mL; contra Gram positiva: Micrococcus luteus 4 μg/mL e Staphylococcus aureus 32 μg/mL. Não inibiu o crescimento das bactérias Gram-negativas Klebsiella pneumonia, Serratia marcescens, Providencia rettgeri e Morganella morganii até a concentração de 64 μg/mL. Estes resultados podem ser devido à linearidade do peptídeo sintético. Sabemos que algumas atividades biológicas das β-defensinas são dependentes da sua estrutura 3D, portanto, a obtenção dessa toxina na forma recombinante pode potencializar sua atividade antimicrobiana ou até sugerir novas funções. O gene sintético, codificando a fusão proteína de ligação à maltose (MBP) - sítio de reconhecimento da protease TEV – DefbLm02, foi clonado no vetor de expressão pET28a. A proteína de fusão foi expressa em duas cepas de E. coli, BL21 Star e C43, em duas temperaturas, 30°C e 37°C. Após 4 horas de indução com IPTG 1 mM, a combinação BL21 Star e 30°C foi a que apresentou a melhor eficiência de expressão. A maior proporção da proteína foi obtida solúvel após purificação por cromatografia de afinidade, como também após a digestão com TEV. A proteína de fusão foi verificada por Western Blotting, utilizando anticorpo anti-MBP.
RESUMO
Objetivo: realizar um levantamento sistemático da literatura no que tange ao uso de peptídeos antimicrobianos contra periodontopatógenos e indicar quais os peptídeos e micro-organismos mais estudados, com o objetivo final de traçar um perfil das publicações na área. Material e métodos: a busca por artigos ocorreu na base de dados Pubmed, com os seguintes critérios de inclusão: publicação nos últimos dez anos; palavras-chave "Antimicrobial Peptide" and "Periodontal" and "Bacteria", publicados em inglês e disponíveis gratuitamente na íntegra para leitura. Um total de dez artigos foram selecionados após o refinamento dos dados. Resultados: apesar do pequeno número de estudos encontrados, evidencia-se o potencial uso de peptídeos antimicrobianos no controle das principais bactérias periodontopatogênicas. Além disso, os peptídeos produzidos por células da mucosa oral (Defensinas, LL-37 e Histatinas), bem como os micro-organismos Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum, foram os mais estudados. Conclusão: é possível concluir que o uso de peptídeos antimicrobianos como potencial ferramenta no controle microbiano tem uma importância crescente, provavelmente devido à sua ampla aplicabilidade, mecanismos de ação e baixos índices de resistência. Contudo, estudos relacionados à sua toxicidade sobre células humanas, modo de aplicação e ensaios clínicos precisam ser realizados.
Objectives: to perform a systematic review of the literature regarding the use of antimicrobial peptides against periodontopathogens and indicate the most studied peptides and microorganisms, with the final objective of outlining a profile of publications in the area. Material and methods: the search for articles occurred in Pubmed database with the following inclusion criteria: publication in the last 10 years; Keywords "Antimicrobial Peptide" and "Periodontal" and "Bacteria", published in English and freely available for reading. Results: a total of 10 articles were selected after refi ning the data. Despite the small number of studies found, it is evident the potential use of antimicrobial peptides in the control of the main periodontopathogenic bacteria. In addition, the peptides produced by oral mucosa cells (Defensins, LL-37 and Histatins) as well as the microorganisms Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum were the most studied. Conclusion: it is possible to conclude that the use of antimicrobial peptides as a tool in microbial control is of increasing importance, probably due to their wide applicability, mechanisms of action and low resistance indices. However, studies related to its toxicity on human cells, mode of application and clinical trials still need to be performed.
Assuntos
Peptídeos Catiônicos Antimicrobianos , Peptídeos Catiônicos Antimicrobianos/uso terapêutico , Biofilmes/crescimento & desenvolvimento , Doenças PeriodontaisRESUMO
O peptídeo LL-37 (catelicidina derivada de humano), é liberado por algumas células humanas e capaz de neutralizar os tecidos com lipopolissacarídeo (LPS), além de atrair células da polpa, e induzir a angiogênese, características que o tornam um possível adjunto para a regeneração do complexo dentino-pulpar. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro a biocompatibilidade do peptídeo LL-37 nas concentrações de 5 e 10 µg/mL, e sua possível atuação na diferenciação de células-tronco da polpa dentária (DPSC) para odontoblastoslike. Com esse propósito, foram avaliados: (a) a citotoxicidade, pelo teste MTT; (b) a genotoxicidade, através do ensaio do micronúcleo; (c) a produção e quantificação de óxido nítrico; (d) as fases do ciclo celular, por citometria; (e) a expressão de alguns genes associados à formação de tecido mineralizado, através do teste qRT-PCR; (f) o conteúdo de proteína total; (g) a atividade de fosfatase alcalina (ALP); e (h) a produção de sialofosfoproteína dentinária (DSPP), pelo ensaio imunoenzimático ELISA. Foi observado que as concentrações de 5 e 10 µg/mL de LL-37 não foram citotóxicas e ainda aumentaram, em geral, a viabilidade celular (p<0,05), sendo que os maiores valores de absorbância foram observados no 3° dia de contato. As concentrações testadas também não induziram genotoxicidade, após 7 dias de contato, tendo sido genotóxico apenas o grupo controle positivo (EMS) (p<0,05). Ainda, não foi observado diferença estatisticamente significativa na produção de nitrito, pelas células expostas ao LL-37 após 7 dias, em ambas as concentrações. A análise do ciclo celular, evidenciou maior porcentual de células na fase G0/G1, em todos os grupos (p<0,05). Quando estes foram comparados, foi observado maior quantidade de células na fase G0/G1 na concentração de 10 µg/mL de LL- 37 comparada ao grupo controle (p<0,05). Por outro lado, o grupo controle exibiu mais células na fase G2 e em mitose (M) que os grupos tratados com 5 e 10 µg/mL de LL-37 (p<0,05), e mais células na interfase (S) que o grupo tratado com 10 µg/mL de LL-37 (p<0,05). A análise da expressão gênica demonstrou que não houve aumento de expressão dos genes fosfatase alcalina, osteocalcina, osteopontina e Runx2 após tratamento com ambas as concentrações do peptídeo, no 3° dia. Além disso, não foi observado diferença estatisticamente significativa na ALP nos grupos tratados e controle, após 3 e 14 dias, enquanto o conteúdo de proteína total foi maior aos 14 dias nos grupos tratados com LL-37 (p<0,05) Ainda, aos 3 dias, a produção da proteína DSPP foi maior no grupo tratado com 10 µg/mL de LL-37 (p<0,05). Com base nesses resultados, pode-se concluir que o LL-37 é biocompatível nas concentrações testadas nesse trabalho, e ainda aumenta o número de células viáveis, principalmente em período inicial. Além disso, aos 3 dias, na concentração de 10 µg/mL, ele retarda o ciclo celular e aumenta a expressão da proteína DSPP, além de aumentar a síntese proteica aos 14 dias, o que indica que esse peptídeo pode desempenhar algum tipo de função na diferenciação odontoblástica (AU)
The LL-37 peptide (human derived cathelicidin) is released by some human cells and able of neutralizing the tissues that present lipopolysaccharide (LPS), as well as, attracts pulp cells and induces angiogenesis; characteristics that makes it a possible adjunct for regeneration of the dentin-pulp complex. The aim of this study was evaluate in vitro the biocompatibility of LL-37 in the concentrations of 5 and 10 µg/mL, and its possible performance in the differentiation of dental pulp stem cells (DPSC) into odontoblasts-like cells. For this purpose, it was evaluated: (a) the cytotoxicity by MTT assay; (b) the genotoxicity by the micronucleus test; (c) the production and quantification of nitric oxide; (d) the cell cycle, by flow cytometry; (e) the expression of genes associated with the mineralization by qRT-PCR; (f) the total protein content; (g) the alkaline phosphatase activity (ALP); and (h) the production of dentine sialofosfoprotein (DSPP) by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). It was observed that the concentrations of 5 and 10 µg/ml of LL-37 were not cytotoxic, in addition to they increased, in general, the cell viability (p<0,05). Moreover, higher absorbance values were observed on 3rd day of contact. After 7 days, the tested concentrations also did not induce genotoxicity, (p<0,05); only the positive control group (EMS) was genotoxic (p<0.05). Furthermore, there was not statistical significance in the nitrite production by the cells exposed to LL-37 for 7 days, in both concentrations. The cell cycle test showed higher percentage of cells in the phase G0/G1 in all groups (p<0.05). When they were compared, it was noticied that concentration of 10 ug/ml of LL-37 arrested the cells in G0/G1 compared to the control group (p<0.05). On the other hand, the control group, exhibited higher amount of cells in G2 and mitosis (M) than the others (p<0.05) and also higher number of cells in interfase (S) than the group treated with 10 µg/mL of LL-37 (p<0.05). On the 3rd day, the analysis of gene expression demonstrated no increase in the expression of the genes alkaline phosphatase, osteocalcin, osteopontin and Runx2, after treatment with both peptide concentrations. Furthermore, it was not observed statistical significance in the ALP in the treated and control groups after 3 and 14 days, while total protein content was higher in the groups treated with LL-37, at 14 days (p<0.05). On the 3rd day, the production of DSPP protein was higher in the group treated with 10 µg/mL of LL-37 (p<0.05). Based on these results, it can be concluded that LL-37 is biocompatible at these concentrations and increases the number of viable cells, especially in the initial period. Moreover, on the 3rd day, the concentration of 10 µg/mL arrests the cell cycle, and increases the expression of DSPP protein, in addition to raising the protein content at 14 days, which indicates that this peptide may present some kind of function in the odontoblastic differentiation(AU)
